果蠅 (Drosophila melanogaster) 作為一種介於線蟲與小鼠之間的模式生物，已成為神經科學研究中極為重要的對象。隨著 FAFB[7]-FlyWire[1,2,6] 與 HemiBrain[5] 等連接組的建立，研究者獲得了能在全腦尺度上分析，甚至直接模擬神經連結的能力[1]。然而，即便能透過如 Lappalainen et al. (2023) 所示的方式，利用機器學習從加權連接組推測神經活動，仍然受到資訊缺失的限制。例如突觸神經傳導物質的種類、電突觸與神經膠質的作用等都尚不完整，使進一步的分析受到阻礙。Eckstein et al. (2024) 的研究正是針對這些缺口中的首要問題：「 突觸連接的神經遞質 」展開預測與探索。

在討論具體成果前，必須先提到神經科學的一個重要假設：「 Dale’s law 」。該定律假設：「 每個神經元在其所有突觸中僅釋放一種神經傳導物質 」。雖然這一定律在共傳遞 (co-transmission) 發現後被證明並不完全正確，但在資料缺漏的情境下，它依然是一個有用的近似。於這項研究中，研究者利用 Dale’s law 採用前突觸類別統計後，用多數決的方式將突觸層級的預測結果整合為神經元層級的標籤，進而在 FAFB-FlyWire / HemiBrain 等資料上，對全腦尺度的突觸進行遞質類型預測與標註。

該研究透過 VGG 卷積神經網路 (VGG CNN) 分析果蠅腦部的電子顯微鏡影像 (EM)，進行神經遞質的分類，其輸入為每個前突觸為中心的 640 nm 立方體 EM patch。結果顯示，在 6 種神經傳導物質 ( GABA、acetylcholine(ACh)、glutamate(Glu)、serotonin(5-HT)、dopamine(DA)、octopamine(Oct) ) 的分類上，單突觸層級約 87%(FAFB) / 78%(HemiBrain)，以多數決彙整至神經元層級約 94%(FAFB) / 91%(HemiBrain)，在腦區 (neuropil) 與半系譜 (hemilineage) 拆分下仍維持高準確率。研究最終建立了一份全腦化學突觸連結組，為超過十萬個神經元量級標註傳導物質。此外，他們對 183 個半系譜以 Bayes 因子評估後，88% 顯示強烈傾向於單一快速遞質，這被視為 Dale’s law 的發育延伸版本，並被稱為「 Lacin’s law 」，將原本在腹神經索 (Ventral Nerve Cord, VNC) 的觀察延伸至整個大腦。研究亦提出一些假說，例如在控制轉向的迴路中，可能 glutamate 存在同時具有抑制與興奮性的性質，進而參與姿勢控制。

VGG 模型能自動學習辨識突觸中與傳導物質相關的細節，例如囊泡 (vesicles) 大小、突觸後結構密度以及 T-bars、突觸間隙 (synaptic cleft) 的厚度、亮度等。這些影像特徵雖不易由肉眼分辨，但 AI 模型能有效提取並維持跨資料集與腦區的高準確率。為了進一步理解 AI 為何能區分不同傳導物質，研究者還引入 CycleGAN 進行影像轉換實驗，將某類突觸影像「 轉換 」成另一種錯誤的傳導物質型態。透過比較轉換前後的差異，他們發現 acetylcholine(ACh) 的突觸縫隙更亮、glutamate(Glu) 的小泡較大，且 Glu 的 T-bar 較 ACh 更暗。這些差異揭示了 AI 模型所捕捉的細微影像特徵，並提供了人類研究者難以直接察覺的線索。但值得注意的是無法只靠此作為分類依據，他們於實驗中提取了上述三個特徵，並有單用該特徵進行辨識，但發現正確率不足。

最後是該研究的一些固有的限制與問題，首先是在 Hemibrain 資料集中將 glutamate 混淆為 GABA 的機率偏高，可能與樣本處理、神經的截斷、標註策略與解析度差異相關；serotonin 的預測表現最弱，與真實標註稀缺與共傳遞細胞被納入有關。以及該研究是基於已知的神經元進行標註與訓練，因此如果神經元是為上述六種遞質以外的或是有共傳遞的狀況等，將不可能正確判斷，大概率會獲得低置信度的結果，甚至如果有部分特徵重疊還有可能產生高置信度的誤判。

總之，Eckstein et al. (2024) 的研究不僅透過深度學習建立了一份果蠅全腦化學突觸連結組，更藉由 VGG 與 CycleGAN 的方法揭露了與神經傳導物質相關的影像特徵，為未來在全腦尺度上探討神經迴路功能奠定了新的基礎，並隨著他們與 FlyWire 整合後可持續接收社群回饋以改進標註，從而進一步的推進腦科學的研究！

本文章有經過 ChatGPT 5 編修過

  1. Dorkenwald, S., Matsliah, A., Sterling, A. R., Schlegel, P., Yu, S., McKellar, C. E., Lin, A., Costa, M., Eichler, K., Yin, Y., Silversmith, W., Schneider-Mizell, C., Jordan, C. S., Brittain, D., Halageri, A., Kuehner, K., Ogedengbe, O., Morey, R., Gager, J., . . . Murthy, M. (2023). Neuronal wiring diagram of an adult brain. bioRxiv (Cold Spring Harbor Laboratory). https://doi.org/10.1101/2023.06.27.546656
  2. Dorkenwald, S., McKellar, C. E., Macrina, T., Kemnitz, N., Lee, K., Lu, R., Wu, J., Popovych, S., Mitchell, E., Nehoran, B., Jia, Z., Bae, J. A., Mu, S., Ih, D., Castro, M., Ogedengbe, O., Halageri, A., Kuehner, K., Sterling, A. R., . . . Seung, H. S. (2021). FlyWire: online community for whole-brain connectomics. Nature Methods, 19(1), 119–128. https://doi.org/10.1038/s41592-021-01330-0
  3. Eckstein, N., Bates, A. S., Champion, A., Du, M., Yin, Y., Schlegel, P., Lu, A. K., Rymer, T., Finley-May, S., Paterson, T., Parekh, R., Dorkenwald, S., Matsliah, A., Yu, S., McKellar, C., Sterling, A., Eichler, K., Costa, M., Seung, S., . . . Funke, J. (2024). Neurotransmitter classification from electron microscopy images at synaptic sites in Drosophila melanogaster. Cell, 187(10), 2574-2594.e23. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.016
  4. Lappalainen, J. K., Tschopp, F. D., Prakhya, S., McGill, M., Nern, A., Shinomiya, K., Takemura, S., Gruntman, E., Macke, J. H., & Turaga, S. C. (2023). Connectome-constrained deep mechanistic networks predict neural responses across the fly visual system at single-neuron resolution. bioRxiv (Cold Spring Harbor Laboratory). https://doi.org/10.1101/2023.03.11.532232
  5. Scheffer, L. K., Xu, C. S., Januszewski, M., Lu, Z., Takemura, S., Hayworth, K. J., Huang, G. B., Shinomiya, K., Maitlin-Shepard, J., Berg, S., Clements, J., Hubbard, P. M., Katz, W. T., Umayam, L., Zhao, T., Ackerman, D., Blakely, T., Bogovic, J., Dolafi, T., . . . Plaza, S. M. (2020). A connectome and analysis of the adult Drosophila central brain. eLife, 9. https://doi.org/10.7554/elife.57443